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【组织切片】冷冻组织切片的制作
作者:河南卓普教学  发表时间:2018/7/10 14:45:22  来源:KONE平台网娱乐注册 www.sjsyx.com.cn

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    实验步骤


    1. 将未受损伤的组织切剖成小样本,约lcmXIcmX0.4cm。



    2. 将标本放在卡片的一端。标记该卡片,将带有标本的一端浸入液氮中。60s后,取出标本并放在干冰上。修剪卡片,使其大小刚好比组织块稍大些,转入预冷的(-70℃)带有标记的小瓶中。


    3. 切片前,用1%明胶包被洁净的载玻片。加热至50℃使明胶溶于水中,冷却,加入0.02%叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s,取出,自然干燥。


    4. 按照仪器使用说明书,用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5-10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。相关阅读推荐:在保存生物标本时我应该注意什么


    5. 让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2min。


    6. 用PBS洗数次,放入含1%NP-40的PBS中5rain。用PBS洗数次。


    7. 将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗,用含蛋白质的溶液如3%BSA/PBS稀释抗体。


    单克隆抗体zui好选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20-50gg/m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体,以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度,以使特异性抗体的浓度在0.1~10ug/m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的,则制备并测试初始制品的不同稀释度(1:10,1:100,1:1000和1:10 000)。



    8. 将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说,孵育时间可延长至24h,以增加其敏感性。


    9. 用PBS洗3次,每次5min以上。


    10. 加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的,测试1:50—1:1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释,如3%BSA/PBS。


    11. 将样本置湿盒中,于室温下孵育30min。


    12. 用PBS洗3次,每次5min以上。


    13. 配制DAB/金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0.05mol/L Tris缓冲液(pH7.6)中。加lm[0.3%(W/V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0.1ml 3%过氧化氢。如果出现沉淀,用Whatman 1#滤纸(或相似品)过滤。


    14. 将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕/黑色沉淀时,用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1-20min。


    15. 加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。


    16. 用水轻柔冲洗。


    17. 通过各级乙醇使标本依次脱水。在75%乙醇中孵育两次,每次3min,95%乙醇中2次,每次3min,100%乙醇中2次,每次3min。自然干燥。



    18. 加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1#) 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。DPX很快可以凝固,样品便可观察并照相。


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